O jogador de 22 anos se lesionou no primeiro tempo da derrota do Wolves por 2 a 0 para o West Ham United, no último fim de semana, em jogo disputado fora de casa.
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A Copa do Mundo começa no dia 20 de novembro, com Portugal iniciando sua campanha quatro dias depois contra Gana, no Grupo H.
"Pedro Neto sofreu uma lesão no tornozelo contra o West Ham no sábado e detectamos um estiramento dos ligamentos laterais", disse o Wolves em comunicado.
"Após uma avaliação mais aprofundada e a opinião de um especialista esta semana, chegamos a conclusão de que ele deverá passar por uma cirurgia. Isso significa que, infelizmente, ele não estará apto para a próxima Copa do Mundo", acrescentou a equipe.
Neto jogou três vezes por Portugal, indo às redes uma vez pelo selecionado lusitano.
Portugal chegou às oitavas de final da Copa do Mundo de 2018 na Rússia e seu melhor desempenho foi um terceiro lugar em 1966.