De Minaur, 12º no ranking da ATP, fechou o jogo com um duplo 6-4 em pouco mais de uma hora e meia para dar o primeiro ponto do confronto para os australianos.
Na próxima fase, os donos da casa enfrentam o vencedor do duelo entre Grécia e Alemanha, na sexta-feira (5), para conhecerem seu adversário por uma vaga na final.
Djokovic, que na terça-feira desistiu de participar do jogo de duplas contra a República Tcheca por conta das dores no punho, pouco pôde fazer contra um inspirado De Minaur, que venceu 33 dos 34 pontos disputados com seu primeiro serviço.
"Não estava no meu nível. Foi apenas um daqueles dias em que você não se sente no seu melhor", disse "Nole" após a partida.
Esta foi a primeira derrota do número 1 do mundo em território australiano desde 15 de janeiro de 2019, encerrando uma série de 43 vitórias consecutivas.
Faltam menos de duas semanas para o início do Aberto da Austrália (de 14 a 28 de janeiro), torneio em que Djokovic é o grande favorito ao título, no qual já venceu em 10 ocasiões.
O ponto da vitória da Austrália foi conquistado por Ajla Tomljanovic, que no jogo de simples feminino venceu a sérvia Natalija Stevanovic com um duplo 6-1.